yokaのblog

琵琶湖で微生物の研究してます

淡水湖の深層に生息する細菌たち

新しい論文が公開されたので紹介。

ざっくりいうと、

淡水湖の深水層がオモロイ細菌の宝庫であることを報告

した論文。

僕は修士時代の研究で、琵琶湖深層に独特の細菌系統「CL500-11」が大量に生息していることを報告した。それ以降、

淡水湖の深層は未知の微生物の宝庫であり、他にもオモロイ細菌がいるはず

という仮説を検証したくて研究を行ってきた。昨年出した論文はその足掛かりで、CL500-11以外にも深水層に特異的な細菌が存在することを琵琶湖で明らかにした。

今回の論文は「琵琶湖得た仮説を全国の湖に拡張して検証する」という位置づけで、僕が博士課程に戻ってくる前から構想していた、学位論文のメインテーマとなる研究だ。

「大水深淡水湖の細菌図鑑」となるような徹底的・網羅的な研究を目指す

というコンセプトで、

  •  北海道から鹿児島まで、最大水深約50~200 mの全国10の大水深淡水湖を調査
  • 16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスで各湖の細菌群集組成を網羅 
  • 特に注目する細菌系統についてはFISH法にて顕微鏡下で染色し、形態観察と定量
  • 得たデータをもとに先行研究や塩基配列データベースの情報を洗い出し、情報を統合的に整理

という流れで研究を行った。その結果

  • 湖の深層には表層とは全く異なる系統の細菌が生息する
  • これらの系統は世界中の湖に共通して生息する
  • その現存量は最大で全細菌の3割を越え、量的にも寄与が大きい

ということを示した。これで当初の予想通り、めでたく「湖の深層はオモロイ細菌の宝庫」ということを明らかにすることができた。

何が面白い/すごいのか

表向きの回答

今回見つかった「湖の深層に生息する細菌たち」はいずれも培養が難しく、その生態・性質は謎に包まれている。彼らの存在量(これらの系統は湖水1mlあたり10万細胞以上が満遍なく存在している)を考えると、水中の有機物の循環や微生物食物網で不可欠な役割を担っている可能性が高い。今後これらの細菌の生態を詳細に調べることで、物質循環や生態系の重要なプロセスを明らかにできる可能性がある。この問題に挑戦するために、今は各細菌のゲノム情報を構築し、代謝機能などの分析を進めている。

裏で考えていること

「オモロイ細菌の宝庫」というのは湖の深層がもつ一つの側面でしかなく、この生態系にはまだまだ発見が眠っていると考えている。例えば、この研究系は

 なぜ地理的に離れた湖に同じ系統の細菌が生息しているのか?

という疑問に応えうると考えている。摩周湖深層水と琵琶湖の深層水は物理的に隔離されているのに、同じ系統の細菌が生息している。それはなぜか?実は細菌は鳥にくっついて移動してたりするのだろうか?この問題に対してはすでに16S rRNA遺伝子塩基配列の1塩基多型を分析することで、ヒントが得られつつあって、今後さらに解像度を上げてその実態を解明する予定だ。

現在進めているゲノムの分析でも、すでに今回の論文の発見を一部覆すような結果が出ていたりして、次々と新しいデータが得られている。大水深淡水湖は「オモロイ細菌の宝庫」のみならず「オモロイウイルスの宝庫」であり「オモロイ遺伝子の宝庫」であり「オモロイ生命現象の宝庫」でもあると僕は考えていて、そういう方向に研究を成長させていきたいと考えている。そのためには、まずは足場を徹底的に固める必要がある。だから僕はこの研究を「湖の深層にオモロイ細菌がいる」という単なる記載的な研究で終わらせず、湖の深層を「新発見の鉱山」へと開発していくための足掛かりと位置付けている。

(余談)論文投稿プロセス

今回の研究は、2015年の夏に調査して、秋~翌春にかけてデータを出して、2016年の夏に論文を書いて、 11月に投稿した。そこから最初のDecisionまでが4か月弱。ここは本当に長かった。この5月に提出する学振PDの申請に業績を間に合わせたかったこともあり、焦りとストレスの募る日々だった。ようやく返ってきた査読結果はMinor Revision。3名の査読者がいたのだけど、うち1名は実質Major Revisionではないかという修正量で、約2週間かけて直して送り返した。そこからさらに1か月以上待たされ、再査読も覚悟してもう5月中の受理は諦めていたところ、突然アクセプトの連絡で、なんとか申請に間に合わせることができた。なんでこんなに査読が遅いんだと思っていたけど、同じ日に公開された他の論文を見ても、大体11月頃に投稿していたので、みんなそんな感じなのかなぁと。今回は初めてプレプリントサーバーのBiorxivを使ってみたのだけど、おかげで論文がなかなか世に出ないストレスが多少軽減できたのは良かった。プレプリントサーバーに関してはメリットデメリット色々言われているけど、今回使ってみた感想として総じて言えば「思っていたほどの反響は無いけど、同業者の一部は確実に読んでくれている。差し支えないものに関してはどんどん使ったら良いのではないか」という意見だ。プレプリントサーバーの普及は急速に進んでいるから、人口が増えてきたら状況も変わってくるだろうと思うけれど。

そういうわけで、博士課程に戻ってくる前から構想していた研究が一通り論文になったのは嬉しい。当初想定していたよりも研究は順調に進んでいると思う。一方で、すごい人を見ればキリがなくて「自分はまだまだだし、まだまだ行けそうだ」という感覚もある。まだまだこれからです。

 

 

 

 

学生最後の1年

 今日から新年度、博士課程も残り1年を切った。会社を退職して研究に戻ってきて2年、ここまでは研究の勘を取り戻すことに必死だったけど、だんだんこの生活が当たり前になってきて、良い意味でも、悪い意味でも、緊張がほぐれてきた気がする。

 研究に戻ってくる前から重々分かってはいたことだけど、研究者の将来はとても厳しい。しばらく研究していれば具体的なキャリアパスが見えてきて前向きになれるかとも思ったけど、むしろ世知辛い話を直接耳にする機会が増えて、ますます自分の将来を案ずるようになった。僕には、嫌なことが起こりそうになったら、最悪を想像することで予防線を張って、いざその事態が起こった時の精神的ダメージを軽減するような本能が備わっている。だから、研究に復帰するために無我夢中だったフェーズが終わった今、あまり将来に期待せず、いつ辞めることになっても良いように、淡々と研究に接するようになったと思う。

 もちろん研究は楽しいし、毎日本気でやっている。僕は今の仕事が自分に合っていて、前職を辞めて戻ってきて良かったと心の底から思っている。だけど、全身全霊で研究を愛することはしない。

「自分には研究しかない」と思うことをしなくなった

というほうが分かりやすいかもしれない。研究が続けられなくなったときの精神的ショックが怖いし、研究にしがみつくために不利な選択を強いられることが嫌だからだ。この点は、会社を辞めて「これからは命懸けで研究に身をささげるのだ!」と意気込んでいた2年前とは明らかに考え方が変わった。

 研究に対する情熱が無くなったということではない。むしろ、研究は当初の想定以上に色々なことが分かってきて、ますます面白くなってきている。変わったのは、本気で研究を楽しむ自分の上に、もう一段メタな自分を置くようになった、ということだと思う。

「本気」から「淡々と本気」になった

と言ってもいいかもしれない。冷めた目の自分が、没頭しすぎないように常に監視している。もっと言うと、

別に研究以外でも本気を出そうと思えば出せるし、何ならいつでも辞めてやるぞ

と思いながら研究している。というか、そう思うことで安心を得ようとしている。

 こういう考え方の人間は、業界には歓迎されないだろう。それは、何か業界全体にとって不利な出来事があった時に、皆で一丸になって抵抗しようとせず、手のひらを返して真っ先に逃げ出してしまうからだ。だけど、色々考えてみたけど、元来悲観的な性格の僕は、常に研究を見限る準備をした状態で研究を続けることでしか、この厳しい業界で心の安定を得る方法がないのだと思う。

 もちろん、続けるからには本気でやるし、行けるところまで行きたいと思う。こうやって偉そうなことを書いているけど、今の自分は業績的には研究業界から見たらゴミ以下で、いなくなったって全然困らない存在だ。学生最後の1年、もう少しで良い論文が出せそうだし、次の研究の面白いデータもたくさん出ているし、海外にも長期滞在する予定で、D論を書いて、将来を決めなければならない。長い一年になると思う。引き続き、淡々と本気で頑張りたい。

2月琵琶湖

今日は琵琶湖調査の日。昨日までの大雪で北湖は沿岸から真っ白。今年は去年よりも雪が多くて寒いように感じる。
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全層循環が完了して、表層から深層まで酸素たっぷり、水温は表層から湖底まで7.9℃で均一な状態。透明度は7.9mと高くなっていて、ずっと優占していた緑藻は勢力が衰えてきた模様。濾過もいつもよりもスムーズだった。細菌数は3.8×106 cells/ml、ウイルス数は8.7×107 /ml。
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これで今シーズン調査はおしまい。この手作り濾過システムで1年間、水を採りまくった。毎月10Lを1,2回採って、60L採った月もあるから、延べ200Lは濾過しているのではないかと思う。今後しばらくはこのサンプルから生み出された膨大なシーケンスデータの解析に注力する。お世話になった船ともしばらくお別れ。
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船着場には春がきておりました。
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やっぱり現場に出てこそ生物の研究者だと思うので、早いところ分析したデータから新しい仮説を立てて、次の調査にまた来たい。琵琶湖という恰好の研究フィールドにいつでもどこでも簡単にアクセスできるこの環境は本当に素晴らしいと思う。

1月琵琶湖 もうすぐ全循環

 2017年の琵琶湖初め。先週末から続いていた冬の嵐で延期が続いていたけど、ようやく出ることができた。朝の気温は−3℃。船着場はスケートリンク状態で、ロープが凍った雪に埋まってしまっていた。
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比良山も真っ白。12月に雪が少なくて苦戦していたスキー場も喜んでそう。
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遠くの伊吹山もはっきりと。実は積雪世界一を記録した山だったりする。
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この嵐でついに琵琶湖も全循環か、と期待したけど、惜しかった。船上で確認した溶存酸素のプロファイル(↓写真の赤い線)を見ても、湖底直上の数mだけ酸素が低くて、ぎりぎりまだ混ざりきっていないことが分かる。
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表層水温が9.3℃、湖底が8.9℃。今月中には完全に混ざりそうですね。透明度は7.0mでした。
 これまでの研究で、琵琶湖には真冬の全循環の期間限定で優占する細菌がいることが分かっている。Acidobacteria門という土壌ではよく見られる系統の細菌なのだけど、水中に出てくるのはあまり聞かなくて、生態は分かっていない。この細菌が一体何をしているのか、今後採るサンプルで明らかに出来ればと思っている。

seqkitを用いたFASTAのフィルタリング・ソート

世の研究者たちはFASTAファイルのハンドリングにはどのようなツールを使っているのだろうか。

  • 長さでソートしたい
  • 特定の文字列を持つものだけ抽出したい
  • 名前だけ抽出したい
  • 名前を置換したい/通しで付け直したい
  • でかすぎるファイルを分割したい
  • ランダムサンプリングしたい

といった欲望は、シーケンスを扱うすべての研究者たちが持っていそうなものだけど、調べてみても、意外と統一的な方法って無くて、各自が自分なりの方法で作業してるのが実情みたいだ。自分自身もbioperl, biopython, bioawkなど、色々なツールをかじってみたけれど、どれもとっつきにくくて、結局、一番使い慣れているRにパッケージ"seqinr"を入れて作業する方法に落ち着いていた。けどこの方法は、もともと文字列処理が得意でないRに無理矢理FASTAを読み込ませているところもあるので、次世代シーケンサーで出てくるバカでかいFASTA/Qをいじるのには手数もかかるし、重くて結構ストレスが溜まる。結局、もっと効率の良い方法はないか、都度ググって解決する毎日を送っていた。

 そんな中、seqkitというツールを見つけて、試しに使ってみたのだけど、これがシンプルで速くてマジおすすめなので、使い方の備忘のついでに紹介。
bioinf.shenwei.me

元文献

seqkitは以下の論文で2016年10月に発表されている。
journals.plos.org
何ができるのかは、この論文のTable1にまとめられているほか、公式マニュアルの各項目にサンプル付きで詳しく説明されている。

特長

公式ページの"Futures"の項目をもとにポイントだけ訳すと

  • Windows, Mac, Linuxに対応
  • 一つの軽いバイナリファイルだけ入れればOK、コンパイルや付随ソフトのインストール必要なし
  • とても速い、マルチスレッドにも対応
  • 20のコマンドが使えて、マニュアルも充実
  • FASTAもFASTQも読める。gzipで圧縮されていてもそのまま読める
  • 標準入力/出力に対応していて、パイプでコマンドを繋げられる
  • 正規表現が使える
  • 各シーケンスに固有の「ID」を振って分析することもできる
  • ランダムサンプリングやシャッフルコマンドでは、seedを設定でき再現性確保

インストー

超簡単。ダウンロードページからバイナリファイルを手に入れて、パスの通っている場所に置くだけ。Linuxでしか動かしていないけど、Windows版もコマンドプロンプトでexeにアクセスするところまではできたので、同じように使えると思う。

使い方

基本形は

seqkit <コマンド> <オプション> <標準入力> 

という形。これで標準出力がでるので、必要であれば"> output.fa"などを最後に付けて、アウトプットを保存する。入力にはFASTA, FASTQ, それを圧縮した.gzなどが入る。

(1)FASTAファイルの表示や分割

statFASTAのステータスを確認

seqkit stat input.fa

FASTAファイルのシーケンス数、長さの最小・最大・平均・合計を出してくれる。

ちなみに上記のとおり、パイプが使えるので、以下のように書いても同じ結果になる。複数コマンドを繋げたいときは便利(以下同様)

cat input.fa | seqkit stat

head:最初の数シーケンスだけ確認する

seqkit head -n 5 input.fa

シェルのheadと似たようなコマンド。分析の進捗を確認するのに、最初の数シーケンスだけ出力する。-nオプションで何シーケンス出すかを指定できる。

splitFASTAを分割する

seqkit split -s 100000 -2 input.fa

100000シーケンスずつFASTAを切って、カレントディレクトリに出力する。-sでファイル当たりのシーケンス数を指定。-2はtwo-pass modeといって、メモリの消費を抑えることができるらしい。なので、基本は指定しておいた方が良い(ただしFASTAでしか使えないとのこと)。-Oでアウトプットフォルダの指定もできる。

なお、シーケンス数でなく、ファイルの個数で分けたい場合は、-pを使う。例えば、5つに分割したければ、

seqkit split -p 5 -2 input.fa

その他、multipulexバーコードのような、指定した位置の塩基(アミノ酸)配列ごとにファイルを分割したり(-r)、各シーケンスの名前(ID)ごとに分割したり(-i)もできる。

sample:ランダムサンプリング

seqkit sample -n 100 -s 1234 -2 input.fa

-nでシーケンス数を指定する。この場合、インプットからランダムに100シーケンスを選んで出力する。-2は先に書いたものと一緒。-sはランダムサンプリングのseed。defaultは-s 11なので、何も指定しないと何度やっても同じランダムサンプリングの結果が出てくる。毎回結果を変えたいときは毎回違う値をセットする。

なお、シーケンス数ではなく、比率でサンプリング数を指定することもできる。例えば、全シーケンスの10%を出力したければ、

seqkit sample -p 0.1 -2 input.fa

ちなみに、FASTA内のシーケンスをランダムに並び替えるshuffleというコマンドもある。使い方は公式マニュアルを参照

fq2fa:FASTQをFASTAに変換

seqkit fq2fa input.fq.gz > output.fa.gz

そのまんま。.gzのまま使えるのが便利。

fx2tabFASTA/Qをtsvに変換

seqkit fx2tab input.fa

-nで名前だけの出力(シーケンス情報は載せない)にできて、-l-gなどのオプションを使って、長さやGC率などの情報とセットになったテーブルを出すことも可能。シーケンス名を一覧化してエクセルなどで触りたいときに使える。この逆の操作でtab2fxというのもあって、FASTAを長さでフィルタリングするときに使っている(以下参照)。

(2)FASTAの中身をいじる

seq:シーケンスの各種変換

このコマンドはたくさんオプションがあるので、詳細は公式マニュアルを参照。よく使いそうなやつだけリストにしておく。

オプション 機能
-w 改行までの文字数を数値で指定。0で改行無しのFASTAにできる
-p 相補配列を出力
-r 逆配列を出力
-pr 逆相補を出力
-l 小文字に変換
-u 大文字に変換
-n シーケンス名(">"以降)のみ抽出
-s シーケンス本体(">"の無い行)のみ出力
-g ギャップを削除して出力

なお、-wについてはglobal flagといって、seqkitの全コマンドに使えるオプションで、かつdefaultが60に設定されているので、パイプで処理を繋げるときは最後のコマンドに付けないと出力に反映されないので注意。
 ちなみにglobal flagは他にもいくつかあって(詳細は公式マニュアル参照)、そのうち-jではスレッド数を指定できる。defaultは2なんだけど、すでに十分に速いので、値を大きくしても(12とかにしても)、体感速度はそこまで変わらなかった。

sort:シーケンスのソート

seqkit sort -lr2 input.fa

これでシーケンスを長い順にソートできる。-lは長さでソートするためのオプション。そのままだと、昇順(短い順)で出てきてしまうので、-rを付けることで、逆向きにソートするよう指定すれば長い順になる。-2は上記と同じくtwo-pass modeの指定。
 あまり使わなさそうだけど、シーケンスの名前(-n)や、シーケンスそのもの(-s)の順に基づいてソートすることもできる。

(3)特定条件を満たすFASTAのフィルタリング(抽出)

grep:一致する文字パターンを持つシーケンスを抽出

seqkit grep -nrp mojiretsu input.fa

一番感動したのがこれ。これで"mojiretsu"を名前に持つシーケンスだけをフィルタリングできる。この1行で完結できる作業のためにこれまでどれだけの時間を費やしたことか。しかも速い!
-nでシーケンス名(">"以降の列)を対象にして、-pで検索対象の文字列パターンを指定。さらに-rを入れることで、正規表現が使えるようになる。

シーケンスを対象にしたフィルタリングも可能で、例えば

seqkit grep -sirp ^aggtctaa input.fa

で「AGGTCTAA」で始まるシーケンスだけを抽出できる。-sがシーケンスを検索対象にするオプション、-iで大文字小文字の違いを無視するオプション。

さらに縮重塩基や、検索対象の塩基の位置も指定できる。例えば、

seqkit grep -sidp GGGWGG -R 20:100 input.fa

で、「GGGWGG」が20~100塩基目の間に出現する配列だけを抽出できる。-dが縮重塩基を入力にするためのオプション、-Rがコロン区切りで検索対象塩基の位置の最初と最後を指定するオプション。ちなみに、-r-dを一緒に使うと怒られるんだけど、軽く使ってみた感じでは、-dを入れた状態で基本的な正規表現(^とか)は使えそう。完全に上位互換かどうかは調べられていないけど。
 あとはシェルのgrepと同じで、「一致しないもの」を抽出したいときは-vが使える。そのほか、検索したい複数のパターンをリスト化しておいて-fで読み込んで一気に検索、という使い方もできる。

■シーケンスを長さで抽出

2017/03/17追記
以前のバージョンでは長さでの抽出には一手間必要だったのだけど、v0.5.0からこれも一発でできるようになった。便利すぎる!

seqkit seq -m 1000 -M 10000 input.fa > output.fa

-mで最小の長さ、-Mで最大の長さを指定するだけ。上記の例では1000塩基(アミノ酸)以上、10000塩基(アミノ酸)以下のシーケンスのみが抽出できる。

(4)その他

まだ使いこなせていないけど、各シーケンスを名前とは別に「ID」という概念で管理して、ソートしたりフィルタリングしたりすることもできる。例えば、シーケンス名が

>AAAA | BBBBB-CCCC #DDDD

みたいな構造になっているときに、AAAAとかDDDDをキーにしてハンドリングすることができる。

その他まだ使うチャンスがないのだけど、他にも以下のようなコマンドが用意されている。

コマンド 機能
replace シーケンスやシーケンス名の置換。sedで出来ることの他に、リストを参照して複数の置換を一気に行ったり、通しで番号を振りなおしたりもできる
subseq 各シーケンスから特定の領域をのみを抜き出す。手入力の他、gtfやbedファイルでの指定も可能
sliding 各シーケンスを指定した長さ毎に区切る。場所ごとにGC率などを出したいときに使える
locate パターンに合った配列の位置をテーブルにまとめて出力。プライマー領域・ORF・モチーフ等の抽出に使える
rmdup 重複するシーケンス(duplicate)を削除する
common 複数のFASTAファイルに共通して存在するシーケンスを抽出


これまでに試したどのツールよりも圧倒的に使いやすい。FASTAイジリングツールはこれに落ち着きそうです。

琵琶湖納め

 今年最後の琵琶湖に行って来ました。今回はとにかく量が必要で、なんと60Lの採水。琵琶湖を60kgも軽くしてしまった。

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気温7.7℃、水温11.6℃。透明度は5.5mとまだ低くて、緑藻のブルームが続いている。20µmのプランクトンネットをひくとあっという間に真緑に。陸の植物は枯葉になってしまっても、水の中はまだ青々としている↓

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帰ってからはひたすら濾過。とにかく手を動かす。頭は使わない・・・

表層水を5.0μm のフィルターに通したところ。緑藻だけでなく、ミジンコもびっしり↓

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ブルームの正体はMicrasterias。見た目はごついのだけど、横から見ると薄っぺらい。でも、顕微鏡で見るとみんな綺麗に向きがそろっていて、体が光を受けやすい向きになるように上手くできているのが分かる↓

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こいつらどうやって増えるんだろう?と思っていたら、ちょうど分裂中のやつがいた。かわいい↓

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ということで、今年の研究はおしまい。

来年もよろしくお願いします。年明けからかなり忙しそうな感じなので、年末年始はしっかりリフレッシュしてきます。

12月びわこ

今日は月例の琵琶湖の日。車も地面も凍り付く朝。比良山も白くなっていた。

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表層水温は13.1℃、透明度は5mで緑藻が多い様子。前日の嵐のおかげか、表層から水深40mまで綺麗に水が混ざっている状態だった。全層循環までもう少し。しかし湖上は寒い・・・